反相高效液相色譜柱的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分先被沖洗出，而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發(fā)時(shí)間，并使開發(fā)的方法更穩(wěn)定。色譜柱的選擇包括分離模式、色譜填料基質(zhì)及基質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)等。
反相高效液相色譜柱的保護(hù)：
1、用預(yù)柱。（但要注意，若有時(shí)出峰異常，要先看看是不是它有問題了）
2、每次做完分析，都要進(jìn)行沖洗，分析用流動(dòng)相中若無酸、鹽類物質(zhì)，建議用90%甲醇沖洗30~60min；若分析用流動(dòng)相中含以上物質(zhì)，要先用10%甲醇沖洗1小時(shí)左右，再梯度走到90%甲醇沖洗30~60min。有必要時(shí)再循環(huán)幾次，可以適當(dāng)縮短時(shí)間。
若長時(shí)間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲酵或乙封存。
3、若流動(dòng)相中用到離子對試剤，更應(yīng)該好好沖洗，且該色譜柱作為專用，不能再做其它物質(zhì)分析用。因色譜柱填料性質(zhì)已與原來所不同，在該柱上所摸索的色譜條件，可能在其它同類柱子上得不到重現(xiàn)。
4、盡量避免反沖，除非該色譜柱明確說明允許。
5、普通C18柱盡量避免在40℃以上的溫度下分析。
6、定期測柱效，有下降，可以用10%異丙醇甲醇沖洗色譜柱。若柱效還沒有改善，可以再生，甲醇二氯甲烷一甲。
